Banner

QUY TRÌNH RUBELLA REAL-TIME PCR

(Cập nhật: 27/11/2017)

QUY TRÌNH RUBELLA REAL-TIME PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xác định DNA đặc trưng của Rubella bằng hệ thống tự động.

2. Nguyên lý

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gene của rubella theo nguyên phương pháp realtime – PCR.

II. CHUẨN BỊ

1.                 Người thực hiện

-  Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

-  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

-  Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

2.                 Phương tiện, hóa chất

2.1.         Trang thiết bị

-  Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

-  Máy ly tâm MF 80 (Hanil)

-  Tủ lạnh 2°C - 8°C

-  Tủ âm sâu (-20°C)

-  Tủ an toàn sinh học cấp 2

-  Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

-  Máy vortex

-  Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

-  Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

-  Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

-  Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

-  Bộ lưu điện

2.2.Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

-  SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

-  Kit rubella – real TM  (Sacase):

-  Khay đựng bệnh phẩm

-  Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

-  Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

-  Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

-  Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

-  Giấy thấm 

-  Giấy xét nghiệm 

-  Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

-  Bút viết kính 

-  Bút bi 

-  Mũ 

-  Khẩu trang 

-  Găng không có bột

-  Găng tay xử lý dụng cụ 

-  Quần áo bảo hộ 

-  Dung dịch nước rửa tay 

-  Cồn sát trùng tay nhanh 

-  Dung dịch khử trùng 

-  Khăn lau tay 

-  Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

3.  Bệnh phẩm

-  Mẩu sinh thiết dạ dày, nội soi, phân….

-  Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh

-  Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu

4.  Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành được thực hiện theo phương tiện, hóa chất trên

1.  Lấy bệnh phẩm

-    Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh

-    Từ chối những mẫu không đạt yêu cầu

2.  Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Chuẩn bị

Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

Khởi động máy tách chiết DNA/RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống faclcon 15ml và effendorf  loại 1,5 ml để đựng mẫu BP.

Bước 2. Tách chiết DNA bằng hệ thống tự động (theo quy trình tách chiết DNA/RNA tự động)

-  Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

-  Đánh số thứ tự mẫu BP, chứng dương, chứng âm vào ống đựng BP và ống đựng DNA trên khay đựng BP của máy tách chiết DNA/RNA tự động.

-  Sử dụng micropipette  hút 10µl RNA carier  và 10µl HP –IC vào các ống đựng bệnh phẩm

-  Sử dụng micropipette  hút 200 µl BP, chứng dương, chứng âm vào các ống đựng BP theo số thứ tự

-  Đặt khay đựng mẫu BP vào máy tách chiết DNA – RNA tự động

-  Sử dụng đầu đọc mã code FCO AS – 8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy.

-  Ấn nút Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA.

-  Sau khi máy tách chiết DNA – RNA chạy xong, lấy RNA ra khỏi máy, loại bỏ các Protocol và bật tia UV để khử trùng máy.

-  DNA sau khi được tách chiết phải bảo quản ở tủ -20°C.

Bước 3: Chạy Real Time PCR bằng hệ thống máy SaCycler – 96 Real Time PCR System

-  Khởi động máy RT – PCR ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

-  Mở phần mềm Realtime – PCR

-  Chọn Operator: Khoa Vi sinh

-  Chọn Device  handing

-  Chọn thiết bị List devices

-  Chọn chương trình chạy: Helicobacter pylori Real – TM

Stage

Temp, oC

Time

Flourescense detection

Cycle repeat

Hold

95

15 min

-

1

Cycling

95

5s

-

5

60

30s

-

72

15s

-

Cycling

95

5s

-

40

60

30s

FAM, JOE/HEX/Cy3

72

15s

 

 

-  Chọn số lượng mẫu vào phần Sample, số lần lặp lại Replica

-  Chọn Controls: positive (C+) và Negative (C-)

-   Chọn vị trí đặt mẫu.

-  Đặt các mẫu DNA vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

-  Dùng giấy thấm sạch nắp ống trước khi đậy nắp máu.Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang và kết quả RT-PCR sẽ không chính xác.

-  Ấn Start để máy chạy chương trình trên phần mềm tiến hành xác định DNA - Rubella và lưu file chạy vào máy tính.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BP.

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại  hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 - Ct = 30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định mẫu dương tính rubella

- Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

- Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính Neisseria miningitides

- Các mẫu BP có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu BP với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 5: Xác định mẫu BP âm tính rubella

- Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu BP âm tính với Neisseria miningitides

- Nếu mẫu BP có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là CHT trong BP dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu BP bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thong thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

(Lượt đọc: 861)

Tin tức liên quan

  • Cấp cứu 115
  • Đường dây nóng
  • 5 nhiệm vụ trọng tâm 2019
  • Học tập làm theo lời bác
  • Chương trình mục tiêu quốc gia
  • Đại hội đảng
  • Lịch công tác
  • Hình ảnh hoạt động
  • Câu lạc bộ Tim mạch
  • Câu lạc bộ Tiểu đường
  • Câu lạc bộ Hen - COPD
  • Liên kết web
    • Bộ Y Tế
    • Báo Quảng Ninh
    • Sở Y tế Quảng Ninh
    • Báo cáo hoạt động khám chữa bệnh
    • Bệnh viện Bãi Cháy
    • Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh
    • CDC
    • Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm
    • Bệnh viện Cẩm phả
    • Bệnh viện Đa khoa khuc vực Cẩm phả
    • Bệnh viện Lao và phổi
    • Bệnh viện Phục hồi chức năng Quảng Ninh
    • Bệnh viện Việt Nam Thụy Điển Uông Bí
    • Bệnh viện Y dược cổ truyền Quảng Ninh
    • Trung tâm y tế Hạ Long
    • Trung tâm Y tế huyện Ba Chẽ
    • Trung tâm Y tế huyện Bình Liêu
    • Trung tâm Y tế huyện Đầm Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hải Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hoành Bồ
    • Trung tâm Y tế huyện Tiên Yên
    • Trung tâm Y tế huyện Vân Đồn
    • Trung tâm Y tế Thành phố Cẩm Phả
    • Trung tâm Y tế Thành phố Móng Cái
    • Trung tâm Y tế Thành phố Uông Bí
    • Trung tâm Y tế thị xã Đông Triều
    • Trung tâm Y tế thị xã Quảng Yên
    • Bệnh viện 108
    • Trung tâm DI & ADR quốc gia
    • Bệnh viện Bạch Mai
    • Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
    • Bệnh viện Việt Đức
    • Sở Y tế tỉnh Phú Thọ