Banner

QUY TRÌNH INFLUENZA VIRUS A, B REAL-TIME PCR

(Cập nhật: 27/11/2017)

QUY TRÌNH INFLUENZA VIRUS A, B REAL-TIME PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. mục đích

Phát hiện gen đặc trưng của virus cúm A và B trong bệnh phẩm đường hô hấp.

2. Nguyên lý:

Phát hiện gene đặc trưng của các chủng cúm A/B bằng phương pháp realtime PCR

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Trưởng khoa, phó khoa, Cán bộ có trình độ đại học trở lên

- Cán bộ quản lý chất lượng, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Hóa chất

          - Kit dùng real-time PCR xác định Influenza virus A, B: bảo quản nhiệt độ -20°C

          - Bộ đối chứng: DNA chứng dương, chứng âm bảo quản nhiệt độ -20°C

2.2. Thiết bị

          - Máy real-time PCR và hệ thống máy tính cài đặt phần mềm realplex2

          - Máy ly tâm dùng cho tube 0.2ml, tủ thao tác vô trùng, micropipettes 10µl

          - Máy vortex

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Tách chiết DNA

          Theo quy trình tách chiết DNA/RNA thủ công

BƯỚC 1:

-  Cho 300 µl dung dịch lysis solution vào các ống đã đánh dấu

-  Cho 100 µl bệnh phẩm, Vortex đều làm tan bệnh phẩm.

-  Ủ ở 65°C trong vòng 5 phút

-  Spin 10 sec nhằm lắng dung dịch ngưng tụ trên nắp ống xuống, tránh tạo khí dung khi mở nắp ống

BƯỚC 2:

-  Cho 400 µl dung dịch prec sol vào ống đựng bệnh phẩm

-  Trộn đều bằng đảo nhẹ ống eppendorf (inverse) tránh lắc và Vortex

-  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, sẽ có cặn  là xác tế bào màu xám nằm ở đáy ống

-  Loại dung dịch phía trên và thu cặn

BƯỚC 3:

-  Cho 500 µl dung dịch Washing solution 3

-  Trộn đều tương tự bước 2

-  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút

-  Loại dung dịch phía trên và thu cặn

BƯỚC 4:

-  Cho 200 µl dung dịch Washing solution 4

-  Trộn đều tương tự bước 2

-  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút

-  Dùng pipette hút dung dịch phía trên và thu cặn

BƯỚC 5:

-  Làm khô ở 65°C trong vòng 10 – 15 phút để cặn khô hoàn toàn

-  Bổ sung 50 - 100 µl dung dịch Re – buffer

-  Ủ ở 65° trong 5 phút.

-  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút trước khi sử dụng dịch DNA/RNA

2. Khởi động máy và cài đặt chương trình realtime PCR

Bước 1: Khởi động máy

          - Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu xanh là báo hiệu khởi động máy thành công.

          - Bật máy tính và mở chương trình phần mềm

          - Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

          - Xác định vị trí đặt ống PCR

          - Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.

          - Lựa chọn màu FAM + HEX cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm. Trong đó, HEX phát hiện Influenza virus A, B và FAM phát hiện chứng nội tại.

          - Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu là 25µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ

95oC - 15 phút

5 Chu kỳ

95oC - 5 giây

60oC - 20 giây

72oC -15 giây

40 chu kỳ

95oC - 5 giây

60oC - 30 giây + chụp hình

72oC - 15 giây

3. Real-time PCR xác định Influenza virus A, B

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml đặt trên các giá lạnh

Bước 2: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR: viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp, vì máy chụp hình từ trên nắp ống.

Bước 3: Hút vào mỗi tube PCR

+ 10 µl PCR mix 1 FRT

+ 5 µl PCR mix 2

+ 0,5 µl TaqF polymerase

+ 0,5 µl IC

Bước 4: Hút 10 µl chứng dương và dung dịch DNA mẫu BP vào các tube tương ứng). Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp tube ngay để tránh lây nhiễm.

Bước 5: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 7: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

4. Phân tích kết quả

          Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

          - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

          - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BP.

          - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

          - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

          - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: PCR không bị ức chế.

          - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu FAM, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại  hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

          - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

          - Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 - Ct = 30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định mẫu dương tính Influenza virus A, B.

          - Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu HEX

          - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính và có Ct: là những mẫu dương tính Influenza virus A, B.

          - Các mẫu BP có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu BP với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 5: Xác định mẫu BP âm tính Influenza virus A, B.

- Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu HEXvà dương tính với màu FAM, thì kết quả là mẫu BP âm tính với Influenza virus A, B.

- Nếu mẫu BP có tín hiệu khuyếch đại với màu HEX nhưng không có Ct và dương tính với màu FAM, thì kết quả là Influenza virus A, B trong BP dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu HEX và âm tính với màu FAM, thì mẫu BP bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

(Lượt đọc: 712)

Tin tức liên quan

  • Cấp cứu 115
  • Đường dây nóng
  • 5 nhiệm vụ trọng tâm 2019
  • Học tập làm theo lời bác
  • Chương trình mục tiêu quốc gia
  • Đại hội đảng
  • Lịch công tác
  • Hình ảnh hoạt động
  • Câu lạc bộ Tim mạch
  • Câu lạc bộ Tiểu đường
  • Câu lạc bộ Hen - COPD
  • Liên kết web
    • Bộ Y Tế
    • Báo Quảng Ninh
    • Sở Y tế Quảng Ninh
    • Báo cáo hoạt động khám chữa bệnh
    • Bệnh viện Bãi Cháy
    • Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh
    • CDC
    • Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm
    • Bệnh viện Cẩm phả
    • Bệnh viện Đa khoa khuc vực Cẩm phả
    • Bệnh viện Lao và phổi
    • Bệnh viện Phục hồi chức năng Quảng Ninh
    • Bệnh viện Việt Nam Thụy Điển Uông Bí
    • Bệnh viện Y dược cổ truyền Quảng Ninh
    • Trung tâm y tế Hạ Long
    • Trung tâm Y tế huyện Ba Chẽ
    • Trung tâm Y tế huyện Bình Liêu
    • Trung tâm Y tế huyện Đầm Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hải Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hoành Bồ
    • Trung tâm Y tế huyện Tiên Yên
    • Trung tâm Y tế huyện Vân Đồn
    • Trung tâm Y tế Thành phố Cẩm Phả
    • Trung tâm Y tế Thành phố Móng Cái
    • Trung tâm Y tế Thành phố Uông Bí
    • Trung tâm Y tế thị xã Đông Triều
    • Trung tâm Y tế thị xã Quảng Yên
    • Bệnh viện 108
    • Trung tâm DI & ADR quốc gia
    • Bệnh viện Bạch Mai
    • Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
    • Bệnh viện Việt Đức
    • Sở Y tế tỉnh Phú Thọ