Banner

QUY TRÌNH HPV GENOTYPE REALTIME PCR

(Cập nhật: 27/11/2017)

QUY TRÌNH HPV GENOTYPE REALTIME PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Quy định thống nhất các bước tiến hành real-time PCR định tính và lai DNA định genotype HPV.

2. Nguyên lý

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gene của HPV theo nguyên lý phương pháp realtime – PCR.

II. CHUẨN BỊ

1.                 Người thực hiện

-  Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

-  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

-  Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

2.                 Phương tiện, hóa chất

2.1.         Trang thiết bị

-  Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

-  Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

-  Tủ lạnh 2°C - 8°C

-  Tủ âm sâu (-20°C)

-  Tủ an toàn sinh học cấp 2

-  Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

-  Máy vortex

-  Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

-  Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

-  Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

-  Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

-  Bộ lưu điện

2.2.          Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

-  SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

-  Kit HPV – real TM  (Sacase)

-  Bộ kit dùng cho lai phân tử reverse dot blot, bảo quản tối, nhiệt độ 2-8°C

-  Khay đựng bệnh phẩm

-  Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

-  Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

-  Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

-  Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

-  Giấy thấm 

-  Giấy xét nghiệm 

-  Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

-  Bút viết kính 

-  Bút bi 

-  Mũ 

-  Khẩu trang 

-  Găng không có bột

-  Găng tay xử lý dụng cụ 

-  Quần áo bảo hộ 

-  Dung dịch nước rửa tay 

-  Cồn sát trùng tay nhanh 

-  Dung dịch khử trùng 

-  Khăn lau tay 

-  Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

3.                 Bệnh phẩm

Máu toàn phần hoặc Huyết thanh được đựng trọng ống không có chất chống đông

4.                 Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thong tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành được thực hiện theo phương tiện, hóa chất trên

1.                 Lấy bệnh phẩm

-  Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh

-  Từ chối những mẫu không đạt yêu cầu

2.                 Tiến hành kỹ thuật

Chuẩn bị

Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

Khởi động máy tách chiết DNA/RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống faclcon 15ml và effendorf  loại 1,5 ml để đựng mẫu BP.

Tách chiết DNA bằng hệ thống tự động (theo quy trình tách chiết DNA/RNA tự động)

Chuẩn bị mẫu

-  Ống máu chứa BP được ly tâm để tách lấy huyết tương

-  Sử dụng pipette để hút huyết thanh vào ống effendorf  loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự.

-  Chuẩn bị mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

Tiến hành kỹ thuật

-  Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

-  Đánh số thứ tự mẫu BP, chứng dương, chứng âm vào ống đựng BP và ống đựng DNA trên khay đựng BP của máy tách chiết DNA – RNA tự động.

-  Sử dụng micropipette  hút 10µl RNA carier  và 10µl HPV – IC vào các ống đựng bệnh phẩm

-  Đặt khay đựng mẫu BP vào máy tách chiết DNA – RNA tự động

-  Sử dụng đầu đọc mã code FCO AS – 8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy.

-  Ấn nút Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA.

-  Sau khi máy tách chiết DNA – RNA chạy xong, lấy DNA ra khỏi máy, loại bỏ các Protocol và bật tia UV để khử trùng máy.

Khởi động máy và cài đặt chương trình realtime PCR

Bước 1: Khởi động máy

- Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu đèn xanh báo hiệu khởi động máy thành công.

          - Bật máy tính và chọn chương trình phần mềm realplex2.

          - Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công

Lưu ý: Chỉ  khai báo chương trình chạy khi kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR  thành công.

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

          - Xác định vị trí đặt ống PCR

          - Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu BP.

          - Lựa chọn màu FAM + JOE cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm

          - Khai báo các thông số khác: thể tích chạy mẫu là 25µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và loại ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt PCR định tính HPV và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ

95oC -5 phút

40 Chu kỳ

95oC -15 giây

55oC -1 phút + chụp hình

72 oC- 20 giây

Real-time PCR định tính HPV

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml chứa master mix đặt trên giá lạnh

Bước 2: Ly tâm các tube chứa master mix để hóa chất lắng xuống đáy ống

Bước 3: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR

Lưu ý: Viết ký hiệu ở thành ống PCR, tuyệt đối không viết lên nắp vì máy chụp hình từ trên nắp.

Bước 4:  Hút 5,0 µl chứng dương, chứng âm và dung dịch DNA mẫu bệnh phẩm vào các tube tương ứng. Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp ngay để tránh ngoại nhiễm.

Bước 6: Ly tâm các ống PCR để toàn bộ dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 7: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 8: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

          Sau khi kết thúc quá trình real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

          - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và JOE

          - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BP.

          - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

          - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và JOE

          - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu JOE: PCR không bị ức chế.

          - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu JOE chứng tỏ PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, cần tách chiết DNA lại.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

          - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và JOE

          - Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 –Ct=30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định mẫu dương tính HPV

          - Chọn từng mẫu BP chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

- Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính và có Ct <36 là những mẫu dương tính HPV.

          - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính rõ ràng và Ct ≥ 36 thì kết luận là mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện.

- Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính không rõ ràng và Ct≥36 thì kết luận là mẫu nghi ngờ và đề nghị lấy mẫu lại để XN hoặc XN lại sau 1-3 tháng.

Lưu ý: với các mẫu dương tính yếu (Ct>30) phải chạy thêm một phản ứng real-time PCR nữa để đủ lượng DNA cho bước định type HPV.

Bước 5: Xác định mẫu BP âm tính HPV

- Chọn từng mẫu BP, chứng (+) và chứng (-), phân tích trên kênh màu FAM và JOE

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu JOE, thì kết quả là mẫu BP âm tính với HPV.

- Nếu mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu JOE thì mẫu BP bị ức chế, cần tiến hành chạy lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại DNA. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu BP để làm xét nghiệm.

(Lượt đọc: 985)

Tin tức liên quan

  • Cấp cứu 115
  • Đường dây nóng
  • 5 nhiệm vụ trọng tâm 2019
  • Học tập làm theo lời bác
  • Chương trình mục tiêu quốc gia
  • Đại hội đảng
  • Lịch công tác
  • Hình ảnh hoạt động
  • Câu lạc bộ Tim mạch
  • Câu lạc bộ Tiểu đường
  • Câu lạc bộ Hen - COPD
  • Liên kết web
    • Bộ Y Tế
    • Báo Quảng Ninh
    • Sở Y tế Quảng Ninh
    • Báo cáo hoạt động khám chữa bệnh
    • Bệnh viện Bãi Cháy
    • Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh
    • CDC
    • Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm
    • Bệnh viện Cẩm phả
    • Bệnh viện Đa khoa khuc vực Cẩm phả
    • Bệnh viện Lao và phổi
    • Bệnh viện Phục hồi chức năng Quảng Ninh
    • Bệnh viện Việt Nam Thụy Điển Uông Bí
    • Bệnh viện Y dược cổ truyền Quảng Ninh
    • Trung tâm y tế Hạ Long
    • Trung tâm Y tế huyện Ba Chẽ
    • Trung tâm Y tế huyện Bình Liêu
    • Trung tâm Y tế huyện Đầm Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hải Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hoành Bồ
    • Trung tâm Y tế huyện Tiên Yên
    • Trung tâm Y tế huyện Vân Đồn
    • Trung tâm Y tế Thành phố Cẩm Phả
    • Trung tâm Y tế Thành phố Móng Cái
    • Trung tâm Y tế Thành phố Uông Bí
    • Trung tâm Y tế thị xã Đông Triều
    • Trung tâm Y tế thị xã Quảng Yên
    • Bệnh viện 108
    • Trung tâm DI & ADR quốc gia
    • Bệnh viện Bạch Mai
    • Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
    • Bệnh viện Việt Đức
    • Sở Y tế tỉnh Phú Thọ