Banner

QUY TRÌNH HCV GENOTYPE REALTIME-PCR

(Cập nhật: 27/11/2017)

QUY TRÌNH HCV GENOTYPE REALTIME-PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xác định genotype HCV trong huyết tương hoặc huyết thanh bằng hệ thống tự động

2. Nguyên lý

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện genotype RNA của HCV theo nguyên lý phương pháp RT - PCR và realtime – PCR.

II. CHUẨN BỊ

1.                 Người thực hiện

-  Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

-  Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

-  Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

2. Phương tiện, hóa chất

2.1.         Trang thiết bị

-  Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

-  Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

-  Tủ lạnh 2°C - 8°C

-  Tủ âm sâu (-20°C)

-  Tủ an toàn sinh học cấp 2

-  Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

-  Máy vortex

-  Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

-  Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

-  Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

-  Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

-  Bộ lưu điện

a.                                           Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

-  SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

-  Kit HCV genotype – real TM  (Sacase):

-  Khay đựng bệnh phẩm

-  Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

-  Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

-  Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

-  Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

-  Giấy thấm 

-  Giấy xét nghiệm 

-  Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

-  Bút viết kính 

-  Bút bi 

-  Mũ 

-  Khẩu trang 

-  Găng không có bột

-  Găng tay xử lý dụng cụ 

-  Quần áo bảo hộ 

-  Dung dịch nước rửa tay 

-  Cồn sát trùng tay nhanh 

-  Dung dịch khử trùng 

-  Khăn lau tay 

-  Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

2.                 Bệnh phẩm

-                     Máu toàn phần hoặc Huyết thanh được đựng trọng ống không có chất chống đông

3.                 Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành được thực hiện theo phương tiện, hóa chất trên

1.                 Lấy bệnh phẩm

-                     Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh

-                     Từ chối những mẫu không đạt yêu cầu

2.                 Tiến hành kỹ thuật

          Các mẫu BP sau khi đã đo tải lượng virus HCV, cDNA mẫu BP được sử dụng cho XN định genotype HCV, quy trình thực hiện như sau:

Khởi động máy và cài đặt chương trình realtime PCR

Bước 1: Khởi động máy

- Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu đèn xanh báo hiệu khởi động máy thành công.

          - Bật máy tính và mở chương trình phần mềm realplex2.

          - Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công.

Lưu ý: Chỉ  khai báo chương trình chạy khi kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR  thành công.

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

          - Xác định vị trí đặt ống PCR

          - Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu BP.

          - Lựa chọn màu FAM + JOE cho mẫu BP, chứng dương, chứng âm

          - Khai báo các thông số khác: thể tích chạy mẫu là 25 µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và loại ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt định genotype HCV và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ

95oC -5 phút

40 Chu kỳ

95oC -15 giây

65oC -1 phút + chụp hình

Real-time PCR định genotype HCV

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml chứa master mix được đặt trên giá lạnh

Bước 2: Ly tâm các tube chứa master mix để hóa chất lắng xuống đáy ống

Bước 3: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR, mỗi mẫu có 2 tube tương ứng, đặt tên ký hiệu mẫu là 1,6 - ứng với genotype 1-6, ký hiệu mẫu là 2,3 - ứng với genotype 2-3.

Lưu ý: Viết ký hiệu ở thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp vì thiết bị chụp tín hiệu huỳnh quang từ trên nắp.

Bước 4:  Hút 2,5 µl chứng dương, chứng âm và dung dịch cDNA mẫu BP vào các tube tương ứng. Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp ngay để tránh ngoại nhiễm.

Bước 6: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 7: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 8: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Bước 1: Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis để phân tích kết quả, có thể phân tích kết quả ở dạng linear hoặc dạng log:

          - Trong tube HCV genotype 1-6: genotype 1 gắn với màu JOE và genotype 6 gắn với màu FAM

          - Trong tube HCV genotype 2-3: genotype 3 gắn với màu JOE và genotype 2 gắn với màu FAM

Bước 2: Phân tích chứng dương và chứng âm. Chỉ chọn chứng dương và chứng âm, chọn cả hai màu FAM và JOE. Thí nghiệm đạt yêu cầu nếu:

          - Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu nền của màu FAM với genotype 2-6 và màu JOE với genotype 1-3

          - Chứng âm có đường biểu diễn thẳng và không vượt tín hiệu nền với cả hai màu

Bước 3: Phân tích mẫu BP, chọn cả màu FAM và JOE và có thể chọn dữ liệu ở chế độ đã xử lý hoặc chế độ thô để có kết quả chính xác nhất

          - Mẫu BP có đường biểu diễn dương tính tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu BP nhiễm genotype đó, tín hiệu dương tính phải tương đương với tín hiệu dương tính trong phản ứng real-time PCR định lượng HCV.

          - Trường hợp mẫu BP đồng nhiễm nhiều genotype HCV lấy genotype có đường biểu diễn dương tính mạnh nhất và trước chu kỳ 36.

          - Không kết luận với đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và dương tính từ chu kỳ 36 trở về sau.

          - Mẫu BP có đường biểu diễn âm tính với cả 4 genotype, kết luận mẫu nhiễm HCV genotype khác ngoài 4 genotype 1,2,3,6.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thong thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

(Lượt đọc: 936)

Tin tức liên quan

  • Cấp cứu 115
  • Đường dây nóng
  • 5 nhiệm vụ trọng tâm 2019
  • Học tập làm theo lời bác
  • Chương trình mục tiêu quốc gia
  • Đại hội đảng
  • Lịch công tác
  • Hình ảnh hoạt động
  • Câu lạc bộ Tim mạch
  • Câu lạc bộ Tiểu đường
  • Câu lạc bộ Hen - COPD
  • Liên kết web
    • Bộ Y Tế
    • Báo Quảng Ninh
    • Sở Y tế Quảng Ninh
    • Báo cáo hoạt động khám chữa bệnh
    • Bệnh viện Bãi Cháy
    • Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh
    • CDC
    • Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm
    • Bệnh viện Cẩm phả
    • Bệnh viện Đa khoa khuc vực Cẩm phả
    • Bệnh viện Lao và phổi
    • Bệnh viện Phục hồi chức năng Quảng Ninh
    • Bệnh viện Việt Nam Thụy Điển Uông Bí
    • Bệnh viện Y dược cổ truyền Quảng Ninh
    • Trung tâm y tế Hạ Long
    • Trung tâm Y tế huyện Ba Chẽ
    • Trung tâm Y tế huyện Bình Liêu
    • Trung tâm Y tế huyện Đầm Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hải Hà
    • Trung tâm Y tế huyện Hoành Bồ
    • Trung tâm Y tế huyện Tiên Yên
    • Trung tâm Y tế huyện Vân Đồn
    • Trung tâm Y tế Thành phố Cẩm Phả
    • Trung tâm Y tế Thành phố Móng Cái
    • Trung tâm Y tế Thành phố Uông Bí
    • Trung tâm Y tế thị xã Đông Triều
    • Trung tâm Y tế thị xã Quảng Yên
    • Bệnh viện 108
    • Trung tâm DI & ADR quốc gia
    • Bệnh viện Bạch Mai
    • Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ
    • Bệnh viện Việt Đức
    • Sở Y tế tỉnh Phú Thọ