I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Đếm số lượng bản copies của HBV DNA trong một đơn vị thể tích (ml) huyết tương hoặc huyết thanh bằng hệ thống tự động

2. Nguyên lý

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gene của HBV theo nguyên lý phương pháp realtime – PCR.

II. CHUẨN BỊ

1.                 Người thực hiện

-                     Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

-                     Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

-                     Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

2.                 Phương tiện, hóa chất

1.1.         Trang thiết bị

-  Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

-  Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

-  Tủ lạnh 2°C - 8°C

-  Tủ âm sâu (-20°C)

-  Tủ an toàn sinh học cấp 2

-  Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

-  Máy vortex

-  Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

-  Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

-  Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

-  Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

-  Bộ lưu điện                                      

1.2.         Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

-  SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

-  Kit MTB – real TM  (Sacase):

-  Khay đựng bệnh phẩm

-  Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

-  Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

-  Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

-  Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

-  Giấy thấm 

-  Giấy xét nghiệm 

-  Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

-  Bút viết kính 

-  Bút bi 

-  Mũ 

-  Khẩu trang 

-  Găng không có bột

-  Găng tay xử lý dụng cụ 

-  Quần áo bảo hộ 

-  Dung dịch nước rửa tay 

-  Cồn sát trùng tay nhanh 

-  Dung dịch khử trùng 

-  Khăn lau tay 

-  Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

3.                 Bệnh phẩm

-  Máu toàn phần hoặc Huyết thanh được đựng trọng ống không có chất chống đông

4.                 Phiếu xét nghiệm

-  Điền đầy đủ thong tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành được thực hiện theo phương tiện, hóa chất trên

1.                 Lấy bệnh phẩm

-    Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh

-    Từ chối những mẫu không đạt yêu cầu

2.                 Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Chuẩn bị

I.                   Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

II.                Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

III.             Khởi động máy tách chiết DNA/RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

IV.             Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống faclcon 15ml và effendorf  loại 1,5 ml để đựng mẫu BP.

Bước 2. Tách chiết DNA bằng hệ thống tự động (theo quy trình tách chiết DNA/RNA tự động)

-                     Ống máu chứa BP được ly tâm để tách lấy huyết tương

-                     Sử dụng pipette để hút huyết thanh vào ống effendorf  loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự.

-                     Chuẩn bị 3 mẫu CAL1, 3 mẫu CAL2 cho mỗi lần chạy đường chuẩn.

-                     Chuẩn bị mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

·                    Pha stock

          + Cho Negative control (CONTRO -) vào các ống theo bảng sau:

Controls	CONTROL -, µl
CAL 1	1200
CAL 2	1200
CONTROL 1	1200
CONTROL 2	1200
CONTROL INT	300

+ Đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng 2 phút, vortex đều.

+ Ly tâm 5 giây

+ Bảo quản ở nhiệt độ 2-8⁰C, bảo quản tránh ánh nắng trong 30 ngày.

Bước 3: Chạy Real Time PCR bằng hệ thống máy SaCycler – 96 Real Time PCR System

-                     Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

-                     Đánh số thứ tự mẫu BP, 3 mẫu CAL1, 3 mẫu CAL 2, chứng dương, chứng âm vào ống đựng BP và ống đựng DNA trên khay đựng BP của máy tách chiết DNA – RNA tự động.

-                     Sử dụng micropipette  hút 10µl RNA carier  và 10µl HBV – IC vào các ống đựng bệnh phẩm

-                     Sử dụng micropipette  hút 200 µl BP, CAL1. CAL2, chứng dương, chứng âm vào các ống đựng BP theo số thứ tự

-                     Đặt khay đựng mẫu BP vào máy tách chiết DNA – RNA tự động

-                     Sử dụng đầu đọc mã code FCO AS – 8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy.

-                     Ấn nút Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA.

-                     Sau khi máy tách chiết DNA – RNA chạy xong, lấy DNA ra khỏi máy, loại bỏ các Protocol và bật tia UV để khử trùng máy.

-                     Chuẩn bị tủ vô trùng và đặt các Kit định lượng virus HBV Real-TM lên giá lạnh.

-                     Ký hiệu mẫu DNA theo thứ tự. Viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết ký hiệu lên nắp ống vì máy đọc tín hiệu huỳnh quang từ nắp trên nắp.

-                     Ly tâm các tube chứa master mix để hóa chất lắng xuống đáy ống.

-                     Hút 50 µl CAL1, CAL2,  DNA mẫu, chứng âm và chứng dương vào các ống PCR tương ứng. Thao tác mẫu nào chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng chặt nắp tube lại để tránh lây nhiễm.

-                     Lưu ý: Trộn đều DNA BP trước khi hút, với DNA BP bảo quản -20⁰C phải để tan đá và trộn đều,

-                     Ly tâm các ống PCR để toàn bộ dịch lắng xuống đáy ống.

Bước 5: Khởi động máy và khai báo chương trình chạy.                 

-                     Khởi động máy RT – PCR ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

-                     Mở phần mềm Realtime – PCR

-                     Chọn Operator: Khoa Vi sinh

-                     Chọn Device  handing

-  Chọn thiết bị List devices

-  Chọn chương trình chạy: HBV Real – TM Quant DX

Stage	Temp, oC	Time	Flourescense detection	Cycle repeat
Hold	95	15 min	-	1
Cycling	95	5s	-	5
	60	20s	-
	72	15s	-
Cycling	95	5s	-	40
	60	30s	FAM, JOE/HEX/Cy3
	72	15s

-                     Chọn số lượng mẫu vào phần Sample, số lần lặp lại Replicas

-                     Chọn standards và Controls

-                     Chọn vị trí đặt mẫu.

-                     Đặt các mẫu DNA vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

-                     Dùng giấy thấm sạch nắp ống trước khi đậy nắp máu.Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang và kết quả RT-PCR sẽ không chính xác.

-                     Ấn Start để máy chạy chương trình trên phần mềm tiến hành định lượng HBV- DNA và lưu file chạy vào máy tính.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-                     Sau khi kết thúc quá trình RT-PCR, chuyển sang chế độ Analysis và dựa vào đường chuẩn để phân tích

1. Xây dựng đường chuẩn

Dựa vào nồng độ của 3 mẫu CAL1 và 3 mẫu CAL2 để xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn bao gồm 2 điểm chuẩn, mỗi điểm lặp lại 3 lần với nồng độ khác nhau cho từng lot sản phẩm giúp kiểm soát kết quả định lượng, chỉ cần chạy 1 đường chuẩn HBV (Standard) cho mỗi lot sản xuất

Giới hạn định lượng (LOD): 7 - 100,000,000 IU/ml  (9,8 - 170,000,000 copies/ml)

2.  Phân tích kết quả

Bước 1: phân tích chứng âm và chứng dương, lựa chọn các giếng chứng âm và chứng dương, chọn lần lượt màu HEX và FAM để phân tích. Mẫu chứng âm và chứng dương đạt yêu cầu nếu:

          Chứng dương có tín hiệu huỳnh quang màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và có FAM dương tính.

          Chứng âm có tín hiệu huỳnh quang màu HEX âm tính và có FAM dương tính.

Bước 2: Phân tích mẫu BP, chọn các mẫu BP và lựa chọn màu HEX, chia các nhóm đường biểu diễn có các tín hiệu huỳnh quang như sau:

          Nhóm 1: Mẫu dương tính mạnh có đường biểu diễn chuẩn

          Nhóm 2: Mẫu dương tính yếu có đường biểu diễn chuẩn

          Nhóm 3: Mẫu âm tính

          Nhóm 4: Mẫu nhiễu có đường biểu diễn không chuẩn

Bước 3: Phân tích mẫu nhóm 1 và nhóm 2

          Chọn các CAL1, CAL2, chứng âm và các mẫu thuộc nhóm 1 và nhóm 2, kéo baseline càng sát đường biểu diễn của chứng âm càng tốt, đồng thời cao hơn tín hiệu nhiễu cao nhất và các thông số của đường chuẩn phải đạt yêu cầu.

          Chọn Analysis type            Chọn Quantitative with standards để xác định nồng độ DNA – HBV của mẫu BP. Kit định lượng HBV có thể phát hiện nồng độ DNA-HBV trong huyết thanh bệnh nhân từ 9,8 -1,7x10⁷ copies/ml.

          Kết luận:  mẫu dương tính (số lượng copies/ml)

          Mẫu định lượng <9,8 copies/ml, thì kết luận mẫu dương tính dưới ngưỡng định lượng

Mẫu định lượng>1,7x10⁷ copies/ml, thì pha loãng mẫu chạy lại

Bước 4: Phân tích mẫu nhóm 3.

          Chọn các giếng của mâu âm, chọn màu HEX sau đó đến màu Fam. Những mẫu âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM, kết luận mẫu âm tính.

Những mẫu âm tính với cả màu FAM và màu HEX là mẫu âm tính giả, cần tách chiết lại DNA hoặc pha loãng DNA và tiến hành RT-PCR lại.

Bước 5. Phân tích mẫu nhóm 4

          Chọn những mẫu có tín hiệu huỳnh quang bất thường, chọn màu FAM và HEX, kiểm tra ở chế độ dữ liệu thô (monitoring).

          Nếu có đường biểu diễn âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM, kết luận mẫu âm tính.

          Những mẫu có tín hiệu dương tính nhiễu trước chu kỳ 05 là dương tính giả.

          Nếu đường biểu diễn dương tính với màu HEX, chọn những mẫu này, standard và chứng âm. Thay đổi giá trị trên trục y để phóng đại tín hiệu huỳnh quang, đưa về chế độ Analysis, kéo đường baseline về sát tín hiệu nhiễu cao nhất và đọc kết quả.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thong thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm